伯基特淋巴瘤亚型的全基因组格局

引言：本次将为大家介绍一篇发表在blood期刊上的文献，作者RazvanI.Panea等人主要来自杜克大学的基因组和计算生物学中心，题目为Thewhole-genomelandscapeofBurkittlymphomasubtypes。

01

Introduction

Burkitt淋巴瘤（BL）是一种侵袭性很强，由MYC基因异常驱动的非霍奇金淋巴瘤。世界卫生组织（WHO）将它分为3种不同的临床亚型：散发性伯基特淋巴瘤，地方性伯基特淋巴瘤和免疫缺陷相关的伯基特淋巴瘤。

散发性伯基特淋巴瘤是指发生在非特定地理或气候区域的病例。这种类型通常涉及腹部。与地方性淋巴瘤不同的是，只有大约20％的散发性淋巴瘤与EBV感染有关。它在儿童非霍奇金淋巴瘤中占40-50％，在西欧和美国地区仅占成人淋巴瘤的1-2％。

地方性伯基特淋巴瘤主要是指发生在主要发生于撒哈拉以南的非洲儿童中。这种类型通常涉及面部骨骼，特别是颌骨，上颌骨和眼眶。Epstein-Barr病毒（EBV）与超过90％的伯基特地方性淋巴瘤有关。

免疫缺陷性伯基特淋巴瘤是指发生在感染HIV的患者，移植患者（通常是实体器官）或患有其他免疫系统疾病的患者中的病例。伯基特淋巴瘤占艾滋病毒感染者诊断的非霍奇金淋巴瘤的30-40％。然而，艾滋病毒并不直接与癌症形成有关。在伯基特淋巴瘤的这些病例中有30-40％发现与EBV有关。

由于它的发展迅速，所以作者想通过基因组测序来全面了解它的背景。所以本次使用的是全基因组测序（WGS）。

02

MethodandResults

实验：

文章收集了共计例BL正常组织肿瘤组织配对样本，其中60例散发性BL，32例地方性BL和9例HIV相关BL。所有样本均进行了WGS，平均深度75X，其中82例额外进行了RNA-seq。

DNA测序分析：测序完成后首先使用FastQC对FASTQ文件进行质检。然后使用Trimmomatic，BWA，Picard等工具对序列进行比对整理，参考基因组为GRCh38。使用来自GATK4软件的Mutect2、bcftools、Annovar等软件完成对数据的注释。

RNA测序分析：测序完成后首先使用FastQC对FASTQ文件进行质检。使用Trimmomatic，STAR，RSEM等工具进行比对、计算转录本丰度等。使用R软件生成所有统计分析和绘图。

其他分析：对WGS样本还进行了拷贝数变异（CNV）分析，调用的是GATK4工具包。运用Python脚本来识别基因组簇。使用Delly2工具来确定易位。使用Diamond鉴定EBV亚型。并使用EBER原位杂交进行验证。

后续实验：使用GeCKOCRISPR库系统对BL细胞系进行CRISPR筛选。使用ID3和TCF4细胞系进行实验，通过使用CRISPR使蛋白沉默来研究其功能。将Eμ-Myc+小鼠与标准Id3敲除品系小鼠杂交，并追踪了天的存活率。

结果：

通过WGS鉴定BL的体细胞基因组变异

文章对个BL肿瘤及配对样本进行了WGS。这些患者有超过万个变异类型，包括个体细胞变异类型。作者通过使用自主开发的方法鉴定体细胞变异高密度区域，得到个基因组簇，这些簇既包括外显子又包括非编码区，并且在3个以上样品中发现，它们包括至少4种变异，彼此之间的间隔均为bp。作者还发现了个与AID活性相关的体细胞突变。

Circos图显示了通过WGS鉴定BL的基因组簇。（图1）外圈圆环大小反应了相关样本数。MYC，IGLL5，BACH2，ID3和BTG2这些基因的编码区和非编码区均具有多个体细胞变异的显着的基因组簇。可以看到内圈根据突变样本数和CNV标出了扩增（红色）和缺失（蓝色）。内部连线则代表MYC基因（chr8）与免疫球蛋白基因IGH（chr14），IGK（chr2）和IGL（chr22）之间的3种易位。文章还鉴定了MYC（染色体8q24）和ACTB（染色体7p22）之间的新易位，并用Sanger测序证实了这种易位。

图1通过WGS鉴定BL的基因组簇。（N=）

驱动基因的概貌与BL亚型的关系

通过使用自主开发的工具，在BL中鉴定出72个驱动基因。基因热图显示，根据亚型和突变频率发现至少有15名BL患者具有驱动基因。除易位外，MYC中也常发生体细胞突变，另外DDX3X，ARID1A和ID3基因表现出高频率的截短突变和缺失，这与肿瘤抑制物的功能丧失相关。

非编码突变是BLs突变的主要特征，大多数驱动基因都表现出多种非编码突变，并且在超过90％的样本有这种变异。非编码突变的普遍性也显示了WGS识别BL中驱动变异的重要性。许多非编码变异都发生在启动子区域或第一个内含子中。在IGLL5，BACH2，BTG2，BCL6，BCL7A，TCL1A，IRF8，CXCR4，ZFP36L1和S1PR2基因组，非编码变异与体细胞超突变具有一致的模式。

另外，通过WGS检测DLBCL的驱动突变，发现GCB型DLBCL的编码和非编码之间都存在强烈的重叠，其中包括BCL6，DNMT1，BCL7A，IRF8，和FOXO1（P0.01，χ2检验）。

EBV是BL发病的关键因素。其在地方性亚型中富集（81％EBV+;P0.，χ2检验）。在散发性BL患者中，EBV+有20％（图2A）。为了进一步分析了体细胞突变负荷和EBV状态之间的关联。作者发现EBV+患者比EBV–患者具有更高的突变负荷（P10-5，Wilcoxon检验）。当按照BL亚型对患者进行分层时，也观察到这种关联，表明EBV感染与下游遗传事件之间有很强的联系。所以进一步验证了对EBV亚型的影响，发现1型EBV+患者比2型EBV+肿瘤患者具有更高的突变负荷（图2B;P=.，方差分析）。

为了研究这种高突变负荷的出现，作者研究了AID相关突变与EBV亚型之间的关系。发现与EBV–的BLs相比，EBV+的BLs与AID相关突变的比例更高（图2C;P=.，方差分析）。EBV–地方性BL与CT突变密切相关，而EBV+地方性BL与体细胞高突变AID活性失调有关。BCL7A和BCL6变异在地方性亚型中富集，而DNMT1，SNTB2和CTCF突变在HIV和散发性患者中更常见（P.05）。SNTB2突变与EB–患者相关，而IGLL5和BACH2突变与EBV+患者相关（P0.05）。（图2D）

图2BL相关驱动基因热图

BL中的驱动突变相关的表达模式

为了确定差异表达的基因和与每个驱动基因的遗传改变相关的途径，作者通过BL亚型作为变量来进行逻辑回归建模，以解决亚型之间的差异，并且获得相关热图。发现该基因富集为2类，信号传导和代谢途径以及DNA修复。信号通路包括G蛋白介导的事件，在GNA13驱动突变中得到了富集。DNMT1和BCL6中的突变则与DNA修复途径有关。（图3）

图3BL中的基因表达模式。

BL和DLBCL的遗传变异和基因表达比较

BL和DLBCL都是侵袭性B细胞淋巴瘤，它们的形态，免疫表型和遗传学都有相似之处。这使区分BL和DLBCL具有挑战性。鉴于BL和DLBCL的治疗差异很大，因此区别在临床上很重要。因此，使用来自1例DLBCL患者的公开数据，比较了BL和DLBCL的基因改变和基因表达。

比较BL和DLBCL的突变谱，用维恩图显示驱动基因的重合（图4A），用柱状图显示BL和DLBCL中驱动基因的突变频率（图4B）。大约40％的BL驱动基因与DLBCL共享，其余60％在BL中占主导，表明这2种淋巴瘤的突变模式存在差异。进一步比较了BL和DLBCL的表达谱，鉴定了总共个差异表达基因，这些基因区分了至少2种BL亚型。与ABCDLBCL相比，GCBDLBCL在基因表达上更接近BL（图4C）。

（图4D）显示了ABCDLBCL和GCBDLBCL相关的差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）。与DLBCL相比，MYC基因与BL更相关。此外，与DLBCL相比，BL中的细胞周期和MTORC1信号表达更高，而在DLBCL中凋亡和JAK-STAT通路表达更高。

图4BL和DLBCL之间的差异

CRISPR筛选BL驱动基因

为了更好地了解这些驱动基因的功能作用，作者使用完整的sgRNA文库转导了3个BL细胞系（BJAB，BL41，Jijoye），并在2个时间点进行了测序。观察到BL基因富集了与癌症相关的功能，包括MYC靶标，细胞周期和DNA修复以及其他关键细胞过程。这些基因中有15个BL驱动基因。BL和DLBCL之间共享的必需基因包括MYC，BCL6和ARID1A（图4E）。由于DBLCL的遗传异质性可能比BL更大，BL特异性基因少于DLBCL特异性基因。

ID3的生物学效应

ID3是所有3种BL亚型中最经常出现的沉默基因之一，并且突变聚集在HLH区域内（图5A）。因为ID3缺少DNA结合域，所以认为WTID3的作用很大程度上是通过蛋白质水平上的HLH域相互作用来实现的。ID3一般结合E2F蛋白TCF4和TCF12，占检测到的所有肽的85％，TCF3和TCF4大致相等（图5B）。尽管两种基因均在BL中高表达，但在TCF4或TCF12中未观察到突变。

用CRISPR方法进一步研究了ID3互作关系。在WT和相应的ID3敲除细胞系上进行了转录组测序，发现在两组之间有96个基因差异表达（图5D）。细胞周期被认为是是受ID3沉默影响的主要生物过程（图5E;q=0.1，GSEA）。与WT细胞系相比，ID3敲除细胞的BrdU掺入量明显更多（图5F;P.05），表明ID3敲除可加速细胞周期进程。

为了研究TCF4缺失对细胞周期进程的影响。使用CRISPR方法在Burkitt细胞系中的TCF4基因的HLH结构域中引入了早期移码缺失。通过定量PCR（qPCR）分析观察到了表达降低（图5G）。WT和敲除细胞的细胞周期分析显示，与WT细胞相比，TCF4敲除细胞显示BrdU掺入减少（图5H;P.05），表明细胞周期进程减少。因此，ID3在BL中具有促增殖作用，其作用似乎与它的结合伴侣TCF4的作用相反，这与ID3对TCF3和TCF4的抑制作用一致。

使用小鼠模型来验证ID3缺失的影响。剔除Id3的小鼠不会发展为B细胞淋巴瘤，并且具有一定的寿命。经过一系列小鼠实验，这些数据首次证实了ID3缺失在增强MYC在BL发病机理中的体内作用。（图5I-K）

图5BL相关基因缺失的影响

03

Conclusions

通过WGS和转录组测序研究了BL的3个亚型

这3个亚型具有不同的临床表现，其中72个驱动基因都具有编码和非编码突变。在遗传和转录水平上，散发性和HIV亚型比地方性亚型之间的关系要密切得多。通过WGS，发现在BL中几乎所有的遗传驱动因子都有非编码突变，这表明WGS拓宽了我们对于BL亚型理解范围。

通过CRISPR筛选和小鼠模型的实验验证BL驱动基因的功能

在BL细胞系中用CRISPR筛选表明，癌基因和抑癌基因均在细胞增殖中起作用。ID3是所有3种BL亚型中最常见的沉默基因之一。我们用体外和体内方法表明ID3通过在BL细胞中失活TCF3和TCF4来调节细胞增殖。相关数据表明，TCF4可以潜在地补偿TCF3功能的丧失，ID3和MYC之间的协同作用模拟了B细胞中BL的发病机理。

临床意义

由于发现BL的基因组特征，这使我们可以将BL与DLBCL更容易地区分。目前可以通过DNA-seq和RNA-seq来批量获取异质性基因。另外还发现不同的BL亚组其实来自高度共享的遗传起源，因此，与一个亚组相关的治疗方法和临床试验与另一亚组也有关联。

参考文献

PaneaRI,LoveCL,ShingletonJR,etal.Thewhole-genomelandscapeofBurkittlymphomasubtypes.Blood.;(19):-.

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